Plataforma de Microscopía Confocal y Epifluorescencia del IIBCE
Descripción general
La plataforma de microscopía del IIBCE es un centro tecnológico especialziado en microscopía de fluorescencia que brinda servicio técnico, cursos de grado y posgrado y capacita en el uso de estas tecnologías a investigadores del IIBCE y de otros institutos de investigación del Uruguay. Cuenta con colaboración a nivel internacional con referentes en Canadá, Estados Unidos y Alemania y se encuentra en plena fase de crecimiento a nivel académico y tecnológico.
Actualmente contamos con 3 microscopios de fluorescencia disponibles para investigación académica y la industria en general. Son 2 microscopios confocales y un microscopio invertido de epifluorescencia el cual ha sido modificado por nosotros para convertirlo además en el primer microscopio de super resolución del país.
Microscopios Confocales
Microscopio Confocal Olymus FV300. Instalado en un estativo OLYMPUS BX 61, es un microscopio directo y fue el primero instalado en el país. EL mismo ha sido modificado mediante el agregado de 3 láseres de estado sólido de 50 mW de potencia de 488, 561 y 640 nm directamente alineados a la óptica original del microscopio. Cuenta con un sistema de epifluorescencia integrado (filtros para DAPI, FITC, Texas Red, CY5 y DIC), lámpara de luz transmitida y sistema de iluminación DIC. Sus objetivos son 4x NA 0.16, 10x NA 0.3, 20x NA 0.5 y 40x NA 0.75 de aire y 63x (NA 1.42) y 100x (NA 1.2) de aceite.
Microscopio Confocal LSM ZEISS 800. Hasta el momento es el sistema confocal más moderno de nuestro instituto, instalado en un estativo “Axio Observer 2” invertido. Presenta 4 unidades láseres de estado sólido (405, 488, 561 y 640 nm), tecnología semi-espectral de emisión, sistema de epifluorescencia integrado con cámara para adquisición de imágenes a color Axio Cam 505, filtros para DAPI, FITC y Rhodamina y sistema de super resolución AiryScan V1. Con fondos del IIBCE y otros concursados en PEDECIBA y ANII hemos agregado módulos comerciales incluyendo una platina motorizada XY, cabina y platina termostatizada y con regulación de CO2 para experimentos in vivo y soportes para múltiples tipos de muestras. Cuenta con objetivos 10x (NA 0.3), 20x (NA 0.5), 40x (NA 0.95), 40x (NA 0.6) de larga distancia, 63x (NA 1.4) y 100x (NA 1.4). Cuenta tambien con software ZEN Blue 2.3 con módulos para AiryScan Processing, TileScan y Experiment Designer agregados.
Microscopio de Epifluorescencia y super resolución Olympus IX-81
Originalmente este microscopio era un epifluorescencia invertido Olympus IX-81 con cámara de fluorescencia y lámpara de luz transmitida compatible con DIC. A través de fondos del IIBCE y otros concursados en PEDECIBA y ANII lo convertimos en el primer sistema compatible con microscopía TIRF y microscopía de super resolución tipo estocástica. Para ello se acoplaron al microscopio un sistema de iluminación con 3 láseres guiados por fibra óptica de 470, 530 y 640 nm con un máximo de potencia de 1 Watt y modulable (próximamente se instalará una línea en 405 nm con 300 mW de potencia máxima, también modulable. Luego se instaló una óptica custom build que guía los láseres hasta la muestra y una cámara de altísimas prestaciones (incluyendo alta velocidad de adquisición y alta sensibilidad de detección) llamada Prime 95b de Teledyne Photometrics. Además, hemos adquirido una platina motorizada de la empresa ASI, filtros de fluorescencia BFP, FITC, TRITC, CY5 y uno multibanda de 4 rangos compatible con microscopía de super resolución y láseres de alto poder y una lámpara LED de epifluorescencia que cubre el rango de infrarrojo acoplada al mismo camino óptico.
Con respecto a la iluminación TIRF contamos con un módulo de la empresa TIRF LABs y un sistema casero de iluminación HILO que permite iluminar regones específicas en el eje Z de una muestra mejorando la relación señal ruido.
Respecto a los objetivos contamos con un 4x NA 0.16, 10x NA 0.3, 20x NA 0.5, 40x NA 0.75 de aire y objetivos de alta gama 60x NA 1.5 y 100x NA 1.45 de aceite.
El sistema de super resolución es compatible con protocolos de STORM y DNA-PAINT y brindamos el servicio y/o colaboración científica a todos los investigadores.
Colaboraciones internacionales
Contamos además con colaboración internacional de laboratorios expertos en microscopía de super resolución incluyendo el Profesor Peter Kim del SickKids Hospital en Toronto, Canadá; el PhD Luciano Masullo (postdoc del laboratorio de bioquímica de Ralph Jungmann del Max Planck Institute en Alemania, inventor del DNA-PAINT) y el Dr. Markus Sauer de la Universidad de Wurzburg en Alemania, inventor del (d)STORM.
Equipamiento
Microscopio Laser Confocal LSM OLYMPUS FV300
Marca: Olympus
Modelo: BX61, módulo confocal FV300
Cámara CCD: DP70
El microscopio láser confocal está integrado por un microscopio de epifluorescencia Olympus BX61 que contiene los siguientes filtros dicroicos:
1) N-41004 (Texas red) Ex: 596nm Em:620nm
2) U-MWU2 Ex: 330-385nm Em: 420nm. (DAPI)
3) U-MWIBA2 Ex: 460-495nm Em: 510-550nm. (Alexa fluor 488, EGFP, YOYO 1, evita auto-fluorescencia de la clorofila)
4) U-MDICT3 para observaciones DIC.
El módulo confocal acoplado al microscopio de epifluorescencia contiene 3 fotomultiplicadores y consta con los siguientes filtros de barrera:
BA660IF
BA560-600
BA510IF
BA530RIF
BA430-460
BA565IF
El sistema posee 3 láseres de estado sólido de potencia modulable instalados y acoplados por nosotros a la óptica original del microscopio y un láser diodo en el rango UV.
1) Láser Estado Sólido 473 nm LASOS (50 Mw potencia máxima)
2) Láser Estado Sólido 561 nm Obis Coherent (120 mW potencia máxima).
3) Láser Estado Sólido 640 nm Obis Coherent (50 mW potencia máxima).
4) Láser Diodo 405nm original de Olympus.
El microscopio láser confocal es una herramienta fundamental para el estudio de colocalización y localización intracelular de señales marcadas con fluorescencia. El software Olympus Fluoview permite la obtención y el procesamiento de las imágenes. El programa DPController controla la cámara CCD acoplada al microscopio para tomar microfotografías por epifluorescencia, de campo claro, o DIC.
Microscopio Laser Confocal LSM ZEISS 800
Microscopio Confocal ZEISS 800 con módulo AIry Scan 1 y equipo para experimentos in vivo
Marca: ZEISS
Modelo: LSM 800 – AiryScan V1
El microscopio confocal ZEISS 800 constituye un sistema confocal de última generación, siendo ampliamente utilizado en numerosas instituciones internacionalmente y también a nivel local en el Institut Pasteur de Montevideo. Se trata de un sistema modular ampliable, que permite el agregado de nuevos elementos y el consiguiente incremento en las prestaciones que puede ofrecer.
El que se encuentra actualmente instalado en la plataforma del IIBCE es el único en el Uruguay que cuenta con un módulo de super-resolución AiryScan, tecnología de vanguardia que permite aumentar la capacidad resolutiva en un factor de 1.7 en las tres direcciones (x, y, z). Al igual que los otros equipos de la plataforma, a este avanzado microscopio pueden acceder tanto los investigadores del IIBCE como del resto de las instituciones del país.
El equipo cuenta además con muy buenos objetivos de gran apertura numérica junto a modernos sistemas de confocalidad, epifluorescencia y luz transmitida, (ver detalles técnicos a continuación). Contamos además con todo el estativo para realizar TileScan y para el desarrollo de experimentos in vivo en condiciones de temperatura y CO2 controladas.
Descripción técnica del Zeiss LSM800 - AiryScan
Microscopio Axio-Observer 2.0 con filtros cúbicos de epifluorescencia para Rodamina, DAPI, FITC y filtro de luz polarizada. Iluminación por campo claro y sistema DIC para todos los objetivos.
Cámara de Epifluorescencia Color Axio Cam 506.
4 líneas de excitación: láseres de estado sólido (405, 488, 561 y 640 nm), espejos galvanométricos de frecuencia variable, 3 PMTs disponibles (2 multi Alkali y 1 GaASP semi-espectral de alta sensibilidad de detección + 1 detector de campo claro.
Platina motorizada en XY.
Filtros dicroicos móviles para sistema espectral.
Incluye sistema de super-resolución AiryScan.
Software Asociado: Zen Blue 2.3
Módulos agregados: AiryScan Processing, Experiment Designer, TileScan
Objetivos: 10x (aire; AN=0,3), 20x (aire; AN=0,5), 40x (aire; AN=0,95), 40x de larga distancia de trabajo (2 mm WD para plástico, NA 0.6), 63x (aceite, AN=1,4) y 100x (aceite, AN=1,4).
Cabina X1 con temperatura y CO2 controlados y soporte de platina termostatizada. Variadas opciones de platina para diferentes tipos de muestra.
MICROSCOPIO de Epifluorescencia invertido OLYMPUS IX-81 compatible con microscopía de Super Resolución tipo estocástica
Marca: Olympus
Modelo: IX81
Cámara: sCMOS Prime 95b Teledyne Photometrics
Láseres diodo de 1 Watt de Potencia pigtail: 637 nm, 530 nm y 470 nm (próximamente 405 nm 300 mW).
Filtros Dicroicos para iluminación con lámpara de epifluorescencia de la empresa ThorLabs: BFP, GFP, TRITC y CY5.
Filtro Dicroico multibanda de 4 rangos (UV-Azul-Verde-Rojo) para iluminación con láseres de alto poder compatible con microscopía de super resolución de la empresa Chroma.
Además, cuenta con un completo sistema de filtros de polarización para observaciones de contraste interferencial diferencial (técnica de Nomarski).
Camino óptico custom build con iluminación HILO para mejorar la relación señal ruido que puede llegar a iluminación TIRF.
Platina Motorizada MS-2000 de la empresa ASI.
Objetivos de alta apertura numérica para experimentos avanzados de super resolución y/o TIRF.
Computadora de altas prestaciones con tarjeta gráfica de avanzada, disco duro SSD 1 TB y 10 TB de discos de estado sólido.
Sistema completamente controlado por software Micromanager 2.0.
Platina Motorizada XY de la Empresa ASY Imaging
Parte del camino óptico custom build del sistema de super resolución.
Cámara del microscopio de super resolución Prime 95b
Vista superior del camino óptico custom build del microscopio de super resolución.
Costos
Servicios:
Costo del servicio (desglosado por turno de 2 horas)
- Usuarios internos personal (investigadores del IIBCE): US$ 5 (cinco dólares americanos) por turno del ZEISS 800
- Cursos PEDECIBA dictados por usuarios internos: US$ 10 (diez dólares americanos) por turno del OLYMPUS FV300 y US$20 (veinte dólares americanos) por turno del ZEISS 800.
- Usuarios externos académicos (personal): US$ 25 (veinticinco dólares americanos) por turno del ZEISS 800.
- Cursos dictados por usuarios externos académicos (cursos): US$ 35 (treinta y cinco dólares americanos) por turno del ZEISS 800.
- Usuarios externos de otras instituciones no académicas: US$ 60 (sesenta dólares americanos) del ZEISS 800.
Por consultas de cualquier tipo dirigirse a Andrés Di Paolo, Carolina Oliveira o Inés Berrosteguieta.
Correo contacto: reservasconfocal@gmail.com
Integrantes
 | Dr. Pablo Liddle Responsable de Plataforma Confocal / Técnico nivel V |
 | Dr. Juan Carlos Rosillo Técnico nivel IV |
 | Dra. Rosana Rodríguez Casuriaga Miembro Comisión Microscopía Confocal y Epifluorescencia |
 | Dra. Claudia Piccini Miembro Comisión Microscopía Confocal y Epifluorescencia |
 | Dr. Federico Trigo Miembro Comisión Microscopía Confocal y Epifluorescencia |
Contacto:
Mail: reservasconfocal@gmail.com
Exintegrantes de la comisión
 | Dr. Andrés Di Paolo Exresponsable de Plataforma Confocal |
 | Mag. Carolina Oliveira Técnico Asistente de Investigación Nivel II |
 | Mag. Inés Berrosteguieta Técnico Asistente de Investigación Nivel II |